Total Plate Count (TPC)

Prinsip dari metode hitungan cawan atau Total Plate Count (TPC) adalah menumbuhkan sel mikroorganisme yang masih hidup pada media agar, sehingga mikroorganisme akan berkembang biak dan membentuk koloni yang dapat dilihat langsung dan dihitung dengan mata tanpa menggunakan mikroskop. Metode ini merupakan metode yang paling sensitif untuk menentukan jumlah mikroorganisme.Dengan metode ini, kita dapat menghitung sel yang masih hidup, menentukan jenis mikroba yang tumbuh dalam media tersebut serta dapat mengisolasi dan mengidentifikasi jenis koloni mikroba tersebut.

Pada metode ini, teknik pengenceran merupakan hal yang harus dikuasai.Sebelum mikroorganisme ditumbuhkan dalam media, terlebih dahulu dilakukan pengenceran sampel menggunakan larutan fisiologis.Tujuan dari pengenceran sampel yaitu mengurangi jumlah kandungan mikroba dalam sampel sehingga nantinya dapat diamati dan diketahui jumlah mikroorganisme secara spesifik sehingga didapatkan perhitungan yang tepat.Pengenceran memudahkan dalam perhitungan koloni (Fardiaz, 1993). Menurut Waluyo (2005), tahapan pengenceran dimulai dari membuat larutan sampel sebanyak 10 ml (campuran 1 ml/1gr sampel dengan 9 ml larutan fisiologis). Dari larutan tersebut diambil sebanyak 1 ml dan masukkan kedalam 9 ml larutan fisiologis sehingga didapatkan pengenceran 10-2. Dari pengenceran 10-2 diambil lagi 1 ml dan dimasukkan kedalam tabung reaksi berisi 9 ml larutan fisiologis sehingga didapatkan pengenceran 10-3, begitu seterusnya sampai mencapai pengenceran yang kita harapkan.Secara keseluruhan, tahap pengenceran dijelaskan dalam gambar berikut ini.

Teknik pengenceran Sampel

Setelah dilakukan pengenceran, kemudian dilakukan penanaman pada media lempeng agar.Setelah diinkubasi, jumlah koloni masing-masing cawan diamati dan dihitung.Koloni merupakan sekumpulan mikroorganisme yang memiliki kesamaan sifat seperti bentuk, susunan, permukaan, dan sebagainya. Sifat-sifat yang perlu diperhatikan pada koloni yang tumbuh di permukaan medium adalah sebagai berikut:

Besar kecilnya koloni. Ada koloni yang hanya berupa satu titik, namun ada pula yang melebar sampai menutup permukaan medium.
Bentuk. Ada koloni yang bulat dan memanjang. Ada yang tepinya rata dan tidak rata.
Kenaikan permukaan. Ada koloni yang rata dengan permukaan medium, ada pula yang timbul diatas permukaan medium.
Halus kasarnya pemukaan. Ada koloni yang permukaannya halus, ada yang permukaannya kasar dan tidak rata.
Wajah permukaan. Ada koloni yang permukaannya mengkilat da nada yang permukaannya suram.
Warna. Kebanyakan koloni bakteri berwarna keputihan atau kekuningan.
Kepekatan. Ada koloni yang lunak seperti lender, ada yang keras dan kering.

Selanjutnya perhitungan dilakukan terhadap cawan petri dengan jumlah koloni bakteri antara 30-300.Perhitungan Total Plate Countdinyatakan sebagai jumlah koloni bakteri hasil perhitungan dikalikan faktor pengencer.

Keuntungan dari metode TPC adalah dapat mengetahui jumlah mikroba yang dominan. Keuntungan lainnya dapat diketahui adanya mikroba jenis lain yang terdapat dalam contoh.Adapun kelemahan dari metode ini adalah:

Memungkinkan terjadinya koloni yang berasal lebih dari satu sel mikroba, seperti pada mikroba yang berpasangan, rantai atau kelompok sel.
Memungkinkan ini akan memperkecil jumlah sel mikroba yang sebenarnya. Kemungkinan adanya jenis mikroba yang tidak dapat tumbuh karena penggunaan jenis media agar, suhu, pH, atau kandungan oksigen selama masa inkubasi.
Memungkinkan ada jenis mikroba tertentu yang tumbuh menyebar di seluruh permukaan media,sehingga menghalangi mikroba lain. Hal ini akan mengakibatkan mikroba lain tersebut tidak terhitung.
Penghitungan dilakukan pada media agar yang jumlah populasi mikrobanya antara 30 – 300 koloni. Bila jumlah populasi kurang dari 30 koloni akan menghasilkan penghitungan yang kurang teliti secara statistik, namun bila lebih dari 300 koloni akan menghasilkan hal yang sama karena terjadi persaingan diantara koloni.
Penghitungan populasi mikroba dapat dilakukan setelah masa inkubasi yang umumnya membutuhkan waktu 24 jam atau lebih.

Uji Total Plate Count menggunakan media padat dengan hasil akhir berupa koloni yang dapat diamati secara visual dan dihitung. Sebelum diuji di media padat, sampel terlebih dahulu harus diencerkan. Pengenceran sampel dilakukan terhadap sediaan yang akan didentifikasi kemudian ditanam pada media lempeng agar. Jumlah koloni bakteri yang tumbuh pada lempeng agar dihitung setelah inkubasi pada suhu dan waktu yang sesuai.Perhitungan dilakukan terhadap petri dengan jumlah koloni bakteri antara 30-300.Total Plate Countdinyatakan sebagai jumlah koloni bakteri hasil perhitungan dikalikan faktor pengencer.

Teknik pengenceran sampel dilakukan pada metode cawantuang (pour plate). Pada metode tuang, sejumlah sampel dari hasil pengenceran sebanyak 1 ml dimasukkan kedalam cawan petri, kemudian ditambahkan media yang telah disterilkan sebanyak 15-20 ml. Kemudian cawan petri digoyang agar media dan sampel tercampur rata dan biarkan memadat. Hal ini akan menyebarkan sel-sel bakteri tidak hanya pada permukaan media yang kaya oksigen, tetapi ada pula yang tumbuh didalam media yang tidak begitu banyak mengandung oksigen. Secara keseluruhan tahap dalam metode cawan tuang (pour plate) ini dijelaskan pada gambar berikut.

Proses inokulasi bakteri, penuangan media dan penghomogenan larutan

Proses inokulasi bakteri, penuangan media dan penghomogenan larutan

Sementara pada metode lainnya yaitu metode goresan, proses penanaman bakteri hanya dilakukan di permukaan bakteri saja.Teknik ini menguntungkan jika ditinjau dari sudut ekonomi dan waktu, tetapi memerlukan keterampilan-keterampilan yang diperoleh dengan latihan. Penggoresan yang sempurna akan menghasilkan koloni yang terpisah. Tetapi kelemahan metode ini adalah bakteri-bakteri anaerob tidak dapat tumbuh, karena goresan hanya dilakukan di permukaan media saja.

Pertumbuhan bakteri pada metode Spread plate dan Pour plate

Pada gambar diatas dapat anda lihat bahwa pada metode goresan atau spread plate, bakteri hanya tumbuh pada permkaan media yang digores saja, sementara pada metode cawan tuang atau pour plate, bakteri tumbuh tidak hanya di permukaan media saja tetapi diseluruh bagian media.
Dalam melakukan teknik goresan harus memperhatikan beberapa hal berikut ini, antara lain:

Gunakan jarum ose yang telah dingin untuk menggores permukaan lempengan media. Jarum ose yang masih panas akan mematikan mikroorganisme sehingga tidak terlihat adanya pertumbuhan mikroorganisme di bekas goresan.
Sewaktu menggores, jarum ose dibiarkan meluncur diatas permukaan lempengan. Media agar yang luka akan mengganggu pertumbuhan mikroorganisme, sehingga sulit diperoleh koloni yang terpisah.
Jarum ose harus dipijarkan kembali setelah menggores suatu daerah, hal ini dengan tujuan mematikan mikroorganisme yang melekat pada mata jarum ose dan mencegah kontaminasi pada penggoresan berikutnya.
Menggunakan tutup cawan petri untuk melindungi permukaan supaya terhindar dari kontaminasi.
Membalikkan lempengan media agar untuk mencegah air kondensasi jatuh diatas pemukaan media.

Ada beberapa teknik penggesekan, yaitu

1. Goresan T

Lempengan dibagi menjadi 3 bagian dengan huruf T pada bagian luar cawan petri.
Inokulasikan daerah I sebanyak mungkin dengan gerakan sinambung.
Panaskan mata jarum ose dan biarkan dingin kembali.
Gores ulang daerah I sebanyak 3-4 kali dan teruskan penggoresan pada daerah II
Ulangi prosedur diatas untuk melakukan penggoresan untuk daerah III

Goresan T kuadran 3

2. Goresan Kuadran, teknik ini sama dengan goresan T, hanya lempengan agar dibagi menjadi 4

Goresan T kuadran 4

3. Goresan Radian

Goresan dimulai dari bagian pinggir lempengan.
Pijarkan mata jarum ose dan dinginkan kembali
Putar lempengan agar 90 derajat dan buat goresan terputus diatas goresan sebelumnya

4. Goresan Sinambung

Ambil satu mata ose suspense dan goreskan setengah permukaan lempengan agar
Jangan pijarkan ose, putar lempengan 180 derajat, gunakan sisi mata ose yang sama dan gores pada sisa permukaan lempengan agar.

Goresan Sinambung

Perhitungan Koloni Bakteri

Untuk melaporkan analisis mikrobiologi digunakan suatu standar yang disebut “Standard Plate Count” yang menjelaskam cara menghitung koloni pada cawan serta cara memilih data yang ada untuk menghitung jumlah koloni dalam suatu contoh. Cara menghitung koloni pada cawan harus memperhatikan hal-hal berikut ini :

Cawan yang dipilih dan dihitung adalah yang mengandung jumlah koloni antara 25 sampai 250.
Beberapa koloni yang bergabung menjadi satu merupakan suatu kumpulan koloni yang besar dimana jumlah koloninya diragukan, dapat dihitung sebagai satu koloni.
Suatu deretan atau rantai koloni yang terlihat seperti suatu garis tebal dihitung sebagai satu koloni.

Sedangkan data yang dilaporkan sebagai Standard Plate Count (SPC) harus mengikuti peraturan sebagai berikut (SNI 01-2897-1992):

Dipilih cawan petri dari satu pengenceran yang menunjukkan jumlah koloni antara 25-250 koloni.

Contoh:

Pengenceran	Cawan I	Cawan II	Keterangan
10-2	150	350	Yang memenuhi syarat perhitungan adalah cawan 1
10-3	20	35	Yang memenuhi syarat perhitungan adalah cawan II

Jumlah koloni rata-rata àJumlahkedua cawan yang memenuhi syarat dikalikan dengan faktor pengencerannya.

Perhitungan Total Plate Countadalah :

(150 x 1/10^-2) + (25 x 1/10^-3) =(150 x 10²) + (25 x 10³)

2 2

= 15.000 + 25.000 =20.000

Maka jumlah koloni dalam 1 ml adalah 20.000 cfu/ml

Bila salah satu dari cawan petri menunjukkan jumlah koloni ≤25 atau ≥250 maka hitunglah jumlah rata-rata koloni, kemudian dikalikan dengan faktor pengencerannya .

Contoh :

Pengenceran	Cawan I	Cawan II	Jumlah Koloni Rata-Rata
10-2	200	300	=(200 + 300) x 10^-2 2 = 250 x 10^-2
10-3	15	25	= (15 + 25) x 10^-3 2 = 20 x 10^-3

Perhitungan Total Plate Count adalah :

= (250 x 1/10^-2) + (20 x 1/10^-3) = (250 x 10²) + (20 x 10³)

2 2

= 25.000 + 20.000

= 22.500

Maka jumlah koloni dalam 1 ml adalah 22.500 cfu/ml

Bila cawan-cawan dari dua tingkat pengenceran yang berurutan menunjukkan jumlah koloni antara 25-250 à hitunglah jumlah koloni dari masing-masing tingkat pengenceran, dikalikan dengan faktor pengencerannya dan rata-rata jumlah koloni dari kedua pengenceran tersebut.

Contoh:

Pengenceran	Cawan I	Cawan II	Jumlah Koloni Rata-rata
10-2	215	225	= (215 + 225) x 10^-2 2 = 220 x 10^-2
10-3	55	45	= (55 + 45) x 10^-3 2 = 50 x 10^-3

PerhitunganTotal Plate Countadalah :

= (220 x 1/10^-2) + (50 x 1/10^-3) = (220 x 10²) + (50 x 10³)

2 2

= 22.000 + 50.000

= 36.000

Maka jumlah koloni dalam 1 ml adalah 36.000 cfu/ml

Bila hasil perhitungan diatas, pada tingkat pengenceran yang lebih tinggi diperoleh jumlah koloni rata-rata ≥2kali jumlah koloni rata-rata pengenceran dibawahnya, maka dipilih tingkat pengenceran yang lebih rendah.

Bila tidak satupun koloni tumbuh dalam cawan, maka Total Plate Count dinyatakan sebagai <1 dikalikan faktor pengenceran terendah.

Jika seluruh cawan menunjukkan jumlah koloni ≥250, dipilih cawan dari tingkat pengenceran tertinggi kemudian dibagi menjadi beberapa bagian atau sector (2,4, atau 8) dan dihitung jumlah koloni dari satu sektor

Selanjutnya ,Total Plate Count didapatkan dari hasil jumlah koloni dikalikan dengan jumlah sektor, kemudian dihitung rata-rata dari kedua cawan dan dikalikan dengan faktor pengenceran .

Contoh:

Jumlah sektor : 4

Pengenceran	Cawan I	Cawan II	Jumlah Koloni Rata-rata
10-2	Jumlah koloni à 100 x 4= 400	Jumlah koloni à 150 x 4 = 600	500 x 10²
10-3	Jumlah koloni à 175 x 4 = 700	Jumlah koloni à 200 x 4 = 800	750 x 10³

PerhitunganTotal Plate Countadalah :

= (500 x 1/10^-2) + (750 x 1/10^-3) = (500 x 10²) + (750 x 10³)

2 2

= 50.000 + 750.000

= 400.000 = 40 x 10⁴

Maka jumlah koloni dalam 1 ml adalah 40 x 10⁴cfu/ml

Cara Menghitung dan Membulatkan Angka

Dalam melaporkan jumlah koloni atau jumlah koloni perkiraan hanya 2 angka penting yang digunakan, yaitu angka yang pertama dan kedua. Pembulatan angka keatas dengan cara menaikkan angka kedua menjadi angka yang lebih tinggi jika angka ketika adalah 6,7,8,atau 9. Gunakanlah angka 0 pada masing-masing angka pada digit berikutnya. Pembulatan angka kebawah bila angka ketiga adalah 1,2,3, atau 4. Bila angka ketiga adalah angka 5, maka bulatkanlah keatas jika angka kedua merupakan bilangan ganjil atau bulatkan kebawah bila angka kedua merupakan bilangan genap.